近些年来，在PBC发生的免疫学机制方面取得了许多实质性进展，尤其是在发现PBC血清学上出现的AMA识别位点的基础上，鉴定出了同AMA所识别的PDC-E2这一自身抗原表位位点几乎重合的自身反应性的CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞。毋庸置疑的是，获得性免疫系统参与到机体的PBC的疾病发生过程中是非常直接的，T细胞和B细胞都参与疾病的发生之中。但是，免疫反应如何得以精确的调控?耐受打破的根源何在，什么细胞最初损伤了胆管上皮细胞?又是什么影响因素在疾病进程中起着决定性的作用?不同功能亚群的细胞在疾病中扮演怎样的角色?细胞因子的靶向治疗和细胞免疫学的治疗是否具有能够逆转自身免疫耐受的打破的可能性?这些都将在本章节进行探讨。

虽然PBC患者呈现出一系列天然免疫应答参与其中的特征，包括肝脏内出现肉芽肿状炎性灶，血清中高滴度的多克隆抗体IgM，单核细胞对天然免疫病原体模式识别受体的高敏感性，但是与获得性免疫的研究相比，针对天然免疫在PBC疾病中的研究长期受到研究者的忽视。最近一些研究组的研究发现天然免疫在PBC疾病发生中同样具有的重要作用，比如IL-12家族细胞因子，以及一些天然免疫细胞诸如NKT细胞、NK细胞和单核细胞均会参与PBC的炎症反应。此外，非专职免疫细胞BECs同样具有重要的天然免疫作用，能够在多个层次调控天然免疫和获得性免疫应答（图4-2）。这也将在本章节着重讨论。

在PBC患者的门脉胆管破坏区域，存在大量的辅助型CD4 ⁺T细胞和杀伤型CD8 ⁺T细胞，暗示我们在PBC疾病发生中存在细胞免疫学损伤机制。PDC-E2特异的自身反应性CD4 ⁺T细胞仅在PBC患者的外周血和肝脏组织中存在，而健康对照和其他非PBC肝脏疾病对照（如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎）均无法检测到这些自身抗原特异的CD4 ⁺T细胞。与此结果相应的，在PBC患者的肝脏组织以及肝脏周围淋巴结中，PDC-E2自身抗原特异性的CD4 ⁺T细胞出现的频率要高出患者外周血150多倍。也有研究组发现，白细胞抗原HLADR4*0101阳性的患者，其自身反应性的CD4 ⁺T细胞抗原表位同AMA的抗原识别表位存在重合，即PDC-E2内部的硫辛酸结构域中硫辛酸结合位点163~176氨基酸序列。此外，该研究组进一步发现这群自身反应性的T细胞仅在PBC患者中存在促炎症特性，譬如分泌干扰素-γ。自身反应性的T细胞在肝脏门脉区的浸润被认为是PBC的重要免疫学疾病特征，即使是在AMA阴性的PBC的患者中，同样存在针对自身抗原的T细胞浸润存在。

一些研究特别强调了CD8 ⁺T细胞在胆管疾病发生中的重要作用。对显性失活转化生长因子受体Ⅱ（dominant negative transformer growth factorⅡ，dnTGF-βRⅡ，详细说明见疾病动物模型章节）小鼠模型的研究发现，将dnTGF-βRⅡ小鼠的脾脏T细胞过继转输至免疫缺陷的Rag1 ^-/-小鼠后，受体鼠出现了PBC样的症状，这说明了打破耐受后的T细胞足以导致PBC样的症状的发生。而将CD4 ⁺T细胞或者CD8 ⁺T淋巴细胞分别转输至Rag1 ^-/-小鼠之后，CD4 ⁺T淋巴细胞在受体鼠中主要浸润在中央静脉和窦状隙中，与此同时受体鼠会出现严重的肠炎及肺炎等非肝脏特异的自身免疫疾病，并最终造成受体鼠死亡；而单独转输CD8 ⁺T淋巴细胞之后，CD8 ⁺T淋巴细胞会浸润在受体鼠的门脉及胆管周围，出现胆管损伤，出现PBC样的症状。在对另一种PBC疾病动物模型白介素2受体α（interleukin 2 receptor α，IL-2Rα，即CD25，详细说明见疾病动物模型章节）敲除小鼠的研究中发现，IL-2Rα联合CD4分子敲除小鼠胆管炎症没有发生明显改善，而肠道炎症减轻；IL-2Rα联合CD8分子敲除小鼠胆管炎症显著减轻，而肠道炎症无明显改善。这些从动物模型中得到的实验数据，一定程度上表明了CD8 ⁺T细胞在PBC疾病发生中的直接而显著的致病作用，可能是胆管损伤的直接行使者。值得注意的是，HLA-Ⅰ类分子限制性的CD8 ⁺T细胞抗原识别表位位于159~167氨基酸残基，同血清AMA识别的区域极其接近，也与CD4 T细胞抗原识别表位非常类似。

在最近10年的自身免疫性疾病研究领域中，CD4 ⁺T细胞中的调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）无疑是最受关注的研究话题之一。Tregs对于机体调控过度的免疫应答，防止自身免疫性疾病的发生至关重要。实验数据显示，将去除了CD4 ⁺CD25 ⁺的调节性T细胞的CD4 ⁺T细胞转输至胸腺发育缺陷的Nude小鼠之后，将会导致裸鼠产生T淋巴细胞介导的全身性的免疫疾病。临床样本的研究同样显示，在人类肝脏疾病的炎性灶T细胞中，15%的T细胞是CD4 ⁺FoxP3 ⁺的调节性T细胞。而对于外周血淋巴细胞样本分析显示，CD4 ⁺CD25 ^high Tregs在PBC患者及其亲属的外周血CD4 ⁺T淋巴细胞中的比例显著下降，这暗示我们PBC的免疫失衡可能同机体的负调功能下降有关。趋化因子受体的分析也显示，调节性T细胞表达肝脏特异性的趋化因子受体，具有从免疫器官迁移至肝脏的潜能，比如Tregs表达具有向肝脏窦状内皮细胞招募性质的趋化因子受体CXCR3，也表达能够接受炎性灶DC分泌的CCR4配体的趋化因子受体。在疾病动物模型中的研究表明，dnTGF-βRⅡ小鼠中的CD4 ⁺FoxP3 ⁺调节性T细胞无论在体内还是在体外都显示出同野生型Tregs相比明显减弱的抑制功能。与CD4 ⁺的调节性T细胞类似，CD8 ⁺的调节性T细胞是一类非常特殊的调节性T细胞亚群，在PBC患者中出现了表型的改变，包括CD127上调和CD39下调，进一步的功能分析显示，PBC患者来源的CD8调节性T细胞对于IL-10的反应能力显著下降。

综上所述，调节性T细胞功能的下降同样是PBC疾病发生发展的一个特点。基于调节性T细胞的细胞免疫学治疗干预是一种颇具前景的PBC治疗策略。寻找合适的特异的细胞治疗靶点，同时结合负调型的细胞免疫治疗相信能够成为一种新的PBC治疗思路。

IL-17最近被证实在诸多的自身免疫反应中发挥了重要的角色。在胆汁淤积性的肝脏疾病中，直接证明Th17细胞发挥了功能的实验证据还不多。可以肯定的是，IL-17阳性的淋巴细胞在PBC患者的肝脏中存在一定比例的上升。IL-2Rα小鼠疾病模型中显示了Th17细胞在肝脏中的上升，以及汇管区周围IL-17阳性的淋巴细胞浸润。近期的研究显示，IL-2Rα小鼠敲除IL-17A之后，胆管炎症加剧，肠道炎症减轻。这个结果表明，Th17在PBC的疾病发生中可能兼具促进炎症和调节炎症的双重功能。也提醒临床研究者，单一的IL-17去除治疗依然需要慎重。

PBC具有显著的血清学特征是血清中高滴度的IgM和抗自身抗体，而分泌自身抗体的B细胞在疾病的发生中所扮演角色究竟是什么，这个问题依然悬而未决。总体来讲，B细胞在PBC疾病发生中的细胞免疫学行为具有双面性。一方面，B细胞聚集在PBC患者的胆管炎性灶。B细胞分泌大量的抗自身抗原的抗体会产生一系列继发的免疫效应，针对PDC-E2的自身抗体将会显著地抑制酶的催化活性，从而能够加速IgA形式的AMA透过BECs，IgA以二聚体的形式完成转胞吞过程中，将会诱发胆管上皮细胞的凋亡。此外，抗PDC-E2的自身抗体还能够促进免疫系统的交叉提呈作用，进而促进PDC-E2特异性的CD8 ⁺T细胞的生成。尽管如此，临床研究发现，AMA的出现与否以及AMA在血清中的水平，却同PBC患者在接受正常肝脏移植之后的复发比例没有相关性。另一方面，使用抗CD20尝试清除B细胞的PBC临床前治疗试验显示，其治疗效果非常有限，甚至出现加速病程的反效果。此外，在疾病动物模型中的研究也有显示，在疾病晚期使用抗CD20单克隆抗体，或者使用抗CD79的单克隆抗体清除dnTGF-βRⅡ小鼠中的B细胞，不仅会导致小鼠更加严重的门脉区浸润和血清中炎性细胞因子的升高，还会引发更加严重的肠道炎症。B细胞缺陷的μ敲除dnTGF-βRⅡ小鼠，其肝脏的炎症情况相比dnTGF-βRⅡ小鼠更加严重。这似乎表明，B细胞在疾病的发生中发挥了一定程度的积极作用。进一步的转输实验揭示了B细胞在胆管疾病中所发挥的双重作用，将dnTGF-βRⅡ小鼠的CD8 ⁺T细胞和腹腔CD19 ⁺的B细胞联合转输至Rag-1 ^-/-小鼠中，相比单独转输dnTGF-βRⅡ小鼠的CD8 ⁺T细胞的受体鼠，其门脉炎症和胆管损伤明显减轻；但是dnTGF-βRⅡ小鼠的CD8 ⁺T细胞和脾脏CD19 ⁺的B细胞联合转输至Rag-1 ^-/-小鼠，则没有积极的治疗效果。综上所述，B细胞在PBC疾病发生中的作用带有其两面性，而这种两面性是由B细胞自身的异质性决定的，即机体同时存在分泌自身抗体以及促进自身抗原交叉提成的效应性B细胞和具有负调免疫应答作用的调节性B细胞。因此，临床在采取去除B细胞治疗策略时应采取保守的态度，研究者也需要寻找一种新的治疗策略，既能限制效应B细胞功能，同时增强或者至少不影响调节性B细胞的功能，减少Breg缺失对机体造成的副作用。

重要的多功能细胞因子IL-12家族细胞因子（图4-3）主要由天然免疫细胞分泌，它们与PBC的发病高度相关。首先，GWAS的结果显示IL-12A、IL-12受体β2亚基（IL-12RB2）以及IL-12信号下游的转录因子STAT4的多态性均与PBC疾病呈现很高的相关性，这一点在非HLA相关的PBC易感基因中已经详细叙述。其次，在IL-12能够作用的靶细胞中，诸如T细胞、NK细胞、NKT细胞等，均是在PBC疾病发生发展中发挥重要作用的免疫细胞。IL-12对于免疫细胞产生的主要效应是促进Th1型的细胞因子的分泌，增强细胞自身的激活。再者，IL-12通过激活下游的转录因子STAT4能够对Th1型特异性的转录因子T-bet产生稳定作用。再次，针对小鼠模型的研究中也显示，dnTGF-βRⅡ小鼠在敲除IL-12p40亚基之后，胆管区的炎症几乎消失。因此，诸多证据显示，IL-12这一天然免疫反应应答中出现的细胞因子在PBC的疾病中扮演重要角色的可能性很高。另外一点值得注意的是，近几年发现的带有明显炎症抑制作用的新细胞因子IL-35，IL-35是由IL-12p35亚基（即IL-12A）和Ebi3亚基构成的异源二聚体细胞因子。它的受体是IL-12Rβ2和gp130的二聚体。根据GWAS的结果，当然现在还没有确切的实验证据，但是似乎IL-35通路也是一个PBC的敏感信号通路。目前，多数研究者都在关注IL-12的促炎症作用，但IL-35这个细胞因子的抑制炎症的作用同样不能忽视。综上，详细阐述IL-12家族成员在PBC疾病发生发展过程中的调控，也许对全面认识疾病，寻找合适的治疗靶点，以及基础免疫研究都具有有力的推动作用。

临床研究发现，PBC患者的NK细胞，无论是在外周血还是肝脏中，其比例都有所上升。再者，同一研究对NK细胞的免疫功能分析显示，NK细胞的杀伤能力和穿孔素的表达都有所增强。由于NK细胞表达IL-8的受体，或许这种功能的改变与PBC患者外周血中IL-8水平的升高有关。与之相反，NK细胞内IFN-γ、IL-6和IL-8的RNA水平却相对于对照患者样本有所下降。值得注意的是，NK细胞的两项重要免疫学功能，细胞杀伤和细胞因子分泌在应答中处于矛盾的状态。这种表面的功能矛盾是否也同NK细胞自身的异质性有关，或许是两个不同的NK细胞亚群在疾病中的比例发生了变化，从而使得机体稳态被破坏，成为疾病发生的一个重要致病因素。

NKT细胞在自身免疫反应中主要行使天然效应细胞的功能，它的应答过程由抗原提呈细胞通过CD1d分子所提呈的自体和外界的糖脂类抗原所调节。NKT细胞有高效迅速分泌细胞因子和趋化因子的能力，从而能够调节整个免疫应答反应，成为连接天然免疫和获得性免疫之间的桥梁。Chuang及其合作者发现，在dnTGF-βRⅡ小鼠模型中，肝脏内CD1d限制性的NKT细胞显著增多，在接受α-半乳糖酰基鞘氨醇（α-galactosylceramide，α-Galcer）刺激之后，模型鼠来源的NKT细胞表现出增强的γ干扰素分泌能力。与dnTGF-βRⅡ模型鼠相比，CD1d敲除的dnTGF-βRⅡ小鼠的肝脏内浸润的淋巴细胞数量减少，门脉区和胆管炎症均明显减轻。这显示在PBC的发病进程中，NKT可能起到了促进疾病发生的作用。在PBC患者的胆汁淤积过程中，阻滞的胆汁能够激活一系列能够对免疫反应产生调节作用的细胞核受体。一个最典型的例子就是肝脏法尼醇受体（FXR），有研究数据显示FXR是一种胆酸酸感应蛋白，能够调节NKT细胞的激活，也能够通过负调NF-κ B信号通路负调肝脏内的炎症反应。其他的核受体蛋白也能够发挥类似的功能，譬如过糖脂抗原受体、过氧化物媒体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）、维生素D受体，这些生物感应器能够将胆汁淤积的信号免疫反应联系在一起，从而调节肝脏内炎症反应。

作为一种数量巨大、更新迅速的天然免疫细胞，单核细胞的促炎症功能在PBC疾病中显著上调。从基本功能的角度讲，单核细胞在接受Toll样受体配体的刺激后能够分泌多种促炎性细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-18、IL-12和TNF-α，这些细胞因子能够放大T细胞参与的免疫反应，对抗机体感染。在对PBC患者外周血单核细胞的研究中发现，PBC患者外周血单核细胞对于病原体的模式分子刺激更加敏感。使用TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9的配体刺激单核细胞，PBC患者的单核细胞分泌更高水平的促炎性细胞因子例如，IL-1、IL-6和TNF-α。这其中的具体原因不明，但这种单核细胞的敏感性可能同PBC临床患者高发反复性革兰氏阴性菌感染（尿路系统感染，UTI）有关。此外，单核细胞类似于B细胞的抗原提呈功能，可能也同疾病的发生发展有关。

PBC重要的病理学特征之一是肝内小胆管的损伤，然而，在PBC发病过程中胆管上皮细胞（BECs）并非仅仅是受到攻击的靶点，BECs同时通过参与天然免疫反应在PBC发病过程中起到重要的调控作用。由于BECs长期暴露在胆道中丰富的外界抗原之中，因此机体赋予了它强劲的天然免疫应答能力和复杂的免疫应答通路。BECs表达天然免疫模式识别受体，譬如Toll样受体，也表达一些抗菌肽，使机体免于遭受病原体感染，发挥保护作用；BECs也能如同抗原提呈细胞一样，表达主要组织相容性分子和一系列的共刺激分子，促进T细胞的免疫应答；同时BEC也表达一些细胞表面黏附分子，提供淋巴细胞黏附和识别的结构基础；此外，BEC还能分泌一些细胞因子、趋化因子，对白细胞产生一定程度的招募作用；甚至可以介导一些白细胞的凋亡，从而对于过度的免疫反应产生一定的抑制作用，如表4-3所示。

众所周知，细菌和病毒相关的病原体模式分子（pathogen associated molecules pattern，PAMP）能够经过TLR的识别，激发天然免疫应答。胆汁中含有细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和脂肪酸，它们与BECs表面的TLRs受体交联，将会激活TLRs下游的NF-κ B信号，引发BECs产生一系列的免疫反应，这包括促炎性细胞因子诸如IL-6、TNF-α的分泌，也能够促进趋化因子的产生诸如IL-8、CX3CL1、巨噬细胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α）。CX3CL1是一种能由多种上皮细胞分泌的趋化因子，有膜结合形式和分泌形式两种状态，它们能够对表达CX3CL1受体CX3CR1的细胞产生趋化作用，这其中就包括重要的获得性免疫细胞，也是PBC中的主要自身反应性细胞，CD4 ⁺T细胞和CD8 ⁺T细胞。在PBC患者损伤的胆管周围，既会出现CX3CL1的上调，又会出现表达CX3CR1的T细胞。BECs分泌的MIP-3α则能够招募专职APC和炎性免疫细胞，诸如在上皮中存在的朗格汉斯细胞（Langerhans cell），它们参与到胆管炎症的发生中，将促进获得性免疫应答。BECs在接受到促炎性因子的刺激之后，将会上调诸多的细胞间黏附分子，诸如ICAM-1、LFA-3、VCAM-1，这将使BECs具有调控免疫反应和免疫应答强度的能力。更进一步，BECs还能在炎症反应中上调MHCⅡ类分子和加速免疫反应的共刺激分子CD80、CD86、CD40，从而使BECs具有能促进T细胞的激活和应答的能力。共刺激分子信号CD40/CD40L系统和细胞黏附分子信号LFA-2（CD2）/LFA-3（CD58）系统，还能够促进IL-12的表达，调控炎症反应。另外，在炎症条件下，BECs还能表达TRAIL，这个具有一定的抑制免疫应答的功能的分子。可以看出，在PBC发病进程中，BECs的天然免疫应答功能同样至关重要，T细胞和BECs相互作用结果能够决定疾病的发展方向。