第二章　病　原　学

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的肠道病毒包括柯萨奇病毒（coxsackie virus）A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型；埃可病毒（ECHO viruses）和肠道病毒71型（EV71），其中以EV71及Cox A16型最为常见。

目前根据肠道病毒（enterovirus，EV）分型已发现超过90种血清型。所有血清型的发现分为3个阶段。三种脊髓灰质炎血清型是在20世纪上半叶从非人灵长类动物中首次分离出来的。在中世纪使用实验小动物和细胞培养技术从而发现了61种甚至更多的肠道病毒血清型如：柯萨奇病毒、埃可病毒和新肠道病毒。之后利用聚合酶链式反应（PCR）和基因测序的方法发现了另外30多种血清型。

传统的肠道病毒分型主要基于病毒分离和抗血清中和试验。这种方法将EV分为64种血清型，包括脊髓灰质炎病毒1～3，柯萨奇病毒A组1～22、柯萨奇病毒A组24和柯萨奇病毒B组1～6，埃可病毒1～7、埃可病毒9、埃可病毒11～21、埃可病毒24～27、埃可病毒29～33和新肠道病毒68～71。

鉴于传统分类方法在一定程度上受到可应用细胞系和自然情况下EV表型变异等因素限制，自1970年起，新鉴定的EV不再归入以上组别，而以数字编码命名。随着分子生物学技术与生物信息学方法的应用，新的EV型别多是采用PCR和基因序列测定技术从患者样本中发现。至今已报道的EV基因型已超过百种，最新序号到了HEVA119，同时根据EV基因构建系统进化树分析，还可将EV区分为不同的基因亚型。

肠道病毒的基因组为单链正链RNA，长度约7500bp。5′端为长度约500bp的非编码区（5′UTR），紧接的是一个编码长度约为2100个氨基酸的多聚蛋白的开放读码框（ORF），随后是3′端非编码区（3′UTR）与多聚腺苷酸尾巴。5′UTR与病毒的多个重要功能有关。对于PV来说，5′端起始的100bp与病毒复制关系密切。肠道病毒采用内部起始翻译模式（internal initiation of translation）而不是细胞mRNA的核糖体扫描模型（ribosome-scanning model）进行病毒蛋白的翻译。这一过程需要大部分PV的5′UTR（从130nt到约600nt处）的参与，不过目前尚不知道确切的核糖体结合序列。采用定向点突变的研究结果显示，5′UTR与病毒的毒力、温度敏感性和病毒感染细胞空斑形态有关。

ORF编码一个多聚蛋白，后者在翻译的同时或翻译后被水解为组成核衣壳的4个结构蛋白（VP4、VP2、VP3、VP1）和7个非结构蛋白。VP1、VP2和VP3均部分暴露在病毒粒子的表面，VP4则完全位于病毒粒子内部。VP1是主要分布于病毒颗粒表面的衣壳蛋白，是中和抗原位点的主要组成部分，该区段的核苷酸序列与肠道病毒血清型相关。采用单克隆中和抗体中和免疫逃逸株，发现在PV病毒的VP2、VP1和（或）VP3存在3或4个中和表位。同样，在CBV3/ CBV4的VP1也发现了中和表位决定簇。不仅如此，核衣壳区被证明与病毒的毒力、病毒粒子的温度稳定性、宿主范围的变化、细胞亲嗜性、病毒持续性感染和病毒在感染细胞中形成的空斑形态密切相关。非结构蛋白及其前体的某些功能已经明确。其中，P2A是病毒的蛋白酶，在多聚蛋白P2A与VP1之间水解多聚蛋白，游离核衣壳蛋白前体。P2A还通过间接诱导细胞P220蛋白的降解，后者是帽依赖转录的关键因子，而参与关闭宿主蛋白翻译。在ORF后的3′UTR长度70～100bp，该区域对于病毒负链合成的启动很重要。

基于肠道病毒VP1的简并引物RT-PCR和核苷酸序列分析，已成为EV血清型鉴定的主要方法，对VP1全部或部分基因序列分析已广泛应用于EV感染的分子流行病学研究。1999年Oberste等建立了根据VP1基因序列分析来鉴定EV型别的方法。通过对47株EV血清型原型株和10株抗原变异株的VP1全长序列测序，联合GenBank中可利用的序列，构成了一个包含66种EV原血清型和另外7种血清型的VP1序列数据库，用这些VP1序列建立的系统发生树，将EV分为A～D组（图2-1）。VP1的3′端基因序列常应用于EV分型、新血清型鉴定和分子流行病学研究。2001年Caro等通过RT-PCR产物测序，鉴定出64株原型株中的59个型，并对45株不同来源的分离株和6株用血清学方法未能定型的病毒株进行了分型。根据建立的系统发生树，他们还将HEV分为5个亚组，形成了一个新的HEV分类方法（图2-2）。有研究表明，VP1分型引物不能对某些埃柯病毒株、柯萨奇病毒株或B组某些EV毒株进行有效扩增。

Nasri等建立了基于VP2抗原表位的基因序列通过RTPCR的方法对EV进行分型，对116株临床和环境来源的EV进行分型结果显示：61株以中和试验定型的EV分型结果完全符合；55株未定型EV中，48株分型结果与VP1分型结果一致，6株鉴定结果分别为EV71、ECV9、ECV30，用VP1分型引物未能扩增，1株以VP1分型鉴定为CVB-4，而以VP2和血清分型结果为CVB-3，进一步分析表明该株为CVB-3/4重组株（图2-3）。

2002年Ishiko等设计引物建立了基于VP4核苷酸序列的系统发生树进行EV基因分型的方法，对来自急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、手足口病和疱疹性咽峡炎等患者的临床分离株的分析结果表明，所有毒株与其同型原型株都有最高的核苷酸同源性，在系统发生树中，96%的毒株都与其同型原型株处在同一簇（图2-4）。

2002年Kubo等对6份手足口病伴无菌性脑炎的病例标本尝试EV分型，采用了对VP4序列分析的方法，结果与血清学检测方法一致（图2-5）。

2002年Manzara等采用了多片段序列分析定型的方法。除VP1、VP4～VP2序列分析外，还应用了5′非编码区序列进行分析，将3段区域序列分析的方法联合使用，实现了对其收集的所有EV标本的分子分型。

利用前述基因分型法对EV71分型。Brown等对1970～1998年美国和其他5个国家的113株EV71病毒基于VP1基因序列分析，将其分为A、B、C 3个基因型，进一步可分为B1、B2、C1和C2基因亚型。其型内变异率低于12%，型间变异率为16. 5%～19. 7%。1970年分离于美国加利福尼亚的BrCr-CA-70原型株属于A型；1972～1988年在澳大利亚和美国、1994年在哥伦比亚和1997年在马来西亚分离株属于B型，1985及以后在美国、加拿大、澳大利亚和中国台湾的EV71感染中分离出C型，马来西亚1997年为B3型，台湾1998年为C2型，澳大利亚1999年为B3型和C2型，新加坡、中国台湾、马来西亚2000年为B4型，韩国2000年为C3型B型和C型基因型的核苷酸年变异率约为1. 35×10 ^-2，与脊髓灰质炎病毒的变异率相似。自1998年以后，美国出现其主要流行毒株B型逐渐被C型所取代的趋势；加拿大、澳大利亚以及中国台湾地区流行毒株属于C型。

1997～2012年，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。通过对当地流行株VP1和（或）VP4核苷酸序列分析，将B和C基因型各分为了4个亚型，且C基因型有逐渐取代B基因型的趋势，这可能是流行后人群免疫屏障压力下，病毒变异引起的。

Mitsuaki等研究了日本福岛1983～2003年和手足口病有关的EV71的基因变异，发现存在众多的基因亚型，包括基因亚型B1-B5、C1-C4，以及C-U1和C-U2，不同基因亚型和不同年份的流行有关。

中国大陆20世纪80年代期间主要是AF135934株的流行，90年代是C3基因亚型，1998年开始出现C4基因亚型流行，并成为优势病毒株，C型株可能具有更强的传染力，但VP1基因与疾病的严重程度无明显关联。据文献报道表明C4b主要流行于1998～2004年，C4a主要流行于2003年到至今，只有2008年安徽和2009年湖北发现了A型。2008～2011年河南省、2009年西安地区、2009年重庆地区、2008～2010年北京地区、2009～2010年苏皖地区、2010年南京地区、2011年郴州市流行的EV71均属于C4亚型，主要为C4a型。

1951年，于南非手足口病患者标本中分离出第1株CoxA16，即CoxA16的原型株CoxA16-G10，自CoxA16-G10首次被分离后30年才再次出现有关CoxA16基因组序列研究的报道。随后，手足口病在东南亚地区广泛流行，CoxA16基因序列大多来自东南亚，均属于B2亚型，其核苷酸和氨基酸的差异分别为0. 1%～10. 8%和0～0. 7%。2001年之后发现的病毒株以B1亚型为主。近10年来，世界范围内流行的CoxA16以B1a和B1b型交互出现，未发现有时间和地点的分布规律。B1c型较少出现，搜集到的核酸序列信息中仅发现了1例来自马来西亚和2例来自法国的毒株。西方国家关于CoxA16的研究较少，从GenBank中检索和相关文献中查阅到的基因序列，经分析均为B1亚型。

目前尚无公认的CA16基因分型依据，最初以VP4和VP1作为对CoxA16基因特征进行分析，将CoxA16分为A、B、C3个基因型。Perera D等使用VP1和VP4对CA16进行了基因的进化分析，发现VP1和VP4的分型结果基本相同，均可将病毒分为A型和B型，其中B型又分为2个分支。

随着核酸序列研究的不断进展，VP1区逐渐成为CoxA16序列分析的主要区域，并将CoxA16分为A、B、C3个基因型，A型仅含有G10 1个毒株。按照肠道病毒分子分型方法，不同基因型间核苷酸差异至少为15. 0%，而B和C型之间核苷酸差异＜13. 8%，因此，把二者归于同一个基因型——B型，并将B和C型分别命名为B2亚型和B1亚型，其中B1亚型又分为B1a、B1b和B1c。Iwai M等利用VP1的基因全序列将日本富山地区1981～2007年的手足口患者的CA16分为A、B、C 3个基因型，其中又将C基因型分为C1、C2、C3 3个亚型，并认为在1995～1998年，CA16由B型向C型转变，在2002年左右，从C1亚型向C2亚型转变，并在2005～2007年转变为C3亚型。

Li等利用CA16的VP4核苷酸序列差异将CA16分为A、B、C3个分支，并认为亚洲在1990年前以A和B 2个分支的流行为主，其中B分支为主要流行株；20世纪90年代后CA16的基因发生了变异导致C分支的出现，并逐步成为主要流行株。

我国学者研究1999～2000年深圳地区、2002年上海地区、2007～2008年北京地区CAl6的分子流行病学情况，结果发现这地区的CAl6基因型为B型和C型。与EV71在中国目前仅流行C4亚型的报道不同，CA16呈多个基因型流行。近11年来，中国内地Cox-A16毒株VP1区基因的变异程度较低，核苷酸变异率为4%～12. 7%。2010年广州地区流行的CAl6病毒可能为B1型。2010～2011年山东大学齐鲁儿童医院任倩等分离的2株柯萨奇病毒均属于B1b型。2009～2010年苏皖地区分离到的CA16毒株也属于B1b基因亚型。

CoxA16A型中仅有G10 1个病毒株，为最早被分离到的毒株。B2型多分离自1981～2000年的日本和马来西亚。2000年以后，B1型取代B2型成为CoxA16主要的流行病毒株，B1a和B1b亚型主要流行于东南亚，而在其他区域较少见。B1c亚型仅见于2005年马来西亚和2010年法国分离的3个病毒株。