第四节　药物经皮吸收的研究方法

药物经皮吸收的过程是一个复杂的过程，影响因素较多。经皮吸收研究的方法、实验装置与材料也多种多样，掌握正确的研究方法，使用合适的实验装置与材料，才能保证研究结果的意义。

一、体外释放试验

1.释放试验方法

药物发挥作用的第一步是从制剂中释放，体外释放是制剂的基本性能之一。体外释放试验可在直立式扩散池（图2-14）中进行。凝胶和软膏等半固体制剂需在扩散池的供应室与接受室之间加人工膜，它们可以是聚砜，醋酸纤维素/尼龙混合酯，或聚四氟乙烯等微孔滤膜。受试品置于扩散池的供应室的人工膜上侧，有效扩散面积为直径为15mm的扩散池，加样量可在300～800mg，视药物与基质的性质、药物的含量而定。供应室保持封闭状态，防止水分或其他溶剂蒸发使样品组分发生改变。透皮贴片等制剂可以直接夹在供应室与接受室之间。接受室中加入接受介质，水溶性药物使用水性缓冲液作接受介质，脂溶性药物在接受介质中加入适当浓度的聚乙二醇400、乙醇、非离子型表面活性剂，增加药物的溶解度，保证实验过程中接受介质符合漏槽条件。

同一个样品需要重复六个，为了避免扩散仪所带来的误差，盛样品与参比制剂的扩散池，在扩散仪中的位置宜间隔排列，如图2-12所示。

实验开始时扩散池的水夹层或水浴维持在（37.0±0.5）℃，接受介质通过磁搅拌子搅拌。分别于一定的时间间隔，取出部分或全部接受介质，同时补充等量同温的接受介质。接受介质测定药物浓度，计算累积释放量。软膏类半固体制剂的实验持续时间可以是6～8h，如在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h取样，透皮贴片的实验持续一般持续至贴片的临床使用时间。

由接受介质测定得到的药物浓度，换算成单位面积累积释放的药物量（μg/cm2），以它与时间的平方根（t1/2）绘图生成一条直线，其斜率代表释放速率。

半固体制剂体外释放试验是亦可在溶出仪中进行的，但需要一个特定装置（图2-13）及水浴温度控制在（32.0±0.5）℃。

透皮贴片的释放速度测定可采用《中国药典》附录中释放度测定的第三法。将释放介质加入到溶出杯中，预热至（32.0±0.5）℃，将透皮贴片固定于两层碟片之间，释放面朝上，再将网碟置于溶出杯下部，搅拌桨与它相距25mm±2mm，搅拌桨转速50r/min，接着如释放度测定样操作。

2.实验数据的处理

外用制剂的释放一般属型，将释放实验每个样品的药物浓度换算成各个时间的单位面积的累积释放量，将它与相应时间的平方根作图，得一条直线，直线的斜率为释放速率。

当比较两个制剂的释放速率时，计算两个制剂的中位释放速率比值的90％置信区间，如果90％置信区间在75％～133.33％的限度范围内，则可以认为两制剂释放速率的差异无统计学意义。如果90％置信区间在75％～133.33％的限度范围之外，则每个制剂重复测定12个样本，每个制剂各用18个释放速率计算90％置信区间，评价两制剂释放速率的差异有无统计学意义。

一般采用非参数法进行90％置信区间的统计学检验。如研究某药物仿制制剂与参比制剂的释放速率差异，得到如下释放速率数据（表2-12）。

先计算两组释放速率相互之间的比值，得到36个（=6×6）T/R比值。它们可以用Excel求得，如表2-13，将参比制剂的释放速率列于第一行，将仿制制剂的释放速率列于第一列，中部为计算得的T/R比值。

将36个T/R比值从低至高进行排序：

0.9128、0.9357、0.9591、0.9832、1.0059、1.0262、1.0311、1.0343、1.0512、1.0776、1.0782、1.0867、1.1004、1.1241、1.1281、1.1308、1.1397、1.1442、1.1454、1.1729、1.1811、1.1817、1.1910、1.2035、1.2371、1.2386、1.2468、1.2621、1.2863、1.2945、1.2964、1.3190、1.3551、1.3808、1.4090、1.4357。

此排序的第8个和第29个比值分别是90％置信区间的下限和上限，即90％置信区间为1.0343～1.2863，或用百分数表示为103.43％～128.63％。

如用18个释放速率计算90％置信区间，可得324个T/R比值（=18×18），则位于第110位和第215位的比值分别是T的中位释放速率与R的中位释放速率比值的90％置信区间的下限和上限。

二、体外经皮渗透研究方法

体外经皮渗透研究的目的是了解药物在皮肤内的渗透过程，研究影响经皮渗透的因素，它是药物、经皮渗透促进剂和组成系统的高分子材料筛选的根据。角质层是大部分药物经皮渗透的主要屏障，而角质层是由“死亡的”角化细胞组成，因此离体经皮渗透实验的研究结果可以基本反映药物在体的吸收过程。

（一）体外经皮渗透实验

体外经皮渗透研究通常是将剥离的皮肤或皮肤替代物夹在扩散池中，药物应用于皮肤的角质层面，在一定的时间间隔测定皮肤另一面接受介质中的药物浓度，分析药物通过皮肤的动力学，求算药物经皮渗透的稳态速率、扩散系数、渗透系数、时滞等参数。

1.实验装置

体外经皮渗透实验一般在扩散池中进行，根据研究目的可以设计或选用不同类型的扩散池。常用的扩散池有三种类型：单室、双室和流通扩散池，它们的基本结构如图2-14、图2-15、图2-16所示。设计扩散池时应考虑的因素：①所用材料不应吸附试验的药物，一般为玻璃，有机玻璃可能对某些药物有较强的吸附能力；②使用、清洗方便，便于安装；③供应室与接受室内都有很好的搅拌，能控制温度；④挥发性药物与介质在供应室内不会挥发；⑤接受室有适当的容积，能在实验过程中维持漏槽条件，接受介质与皮肤的接触界面不残存气泡和不形成屏障层，易观察与采样；⑥皮肤夹在供应室与接受室之间，皮肤的屏障层不会受损害。

Franz扩散池和改良的Franz扩散池是垂直的单室扩散池，常用于药物制剂的透皮速率测定，如软膏和经皮给药系统，也可用于实验过程供应室药物浓度基本上不变如饱和溶液的透皮速率测定。

二室扩散池的每个室都充满液体，皮肤的两面都浸在介质中。如介质是水，能使皮肤水化，引起药物经皮速率的增大。它可用于测定药物通过皮肤或膜的渗透速率，渗透系数和扩散系数。

流通扩散池中接受介质以一定速率泵入与流经接受室，使接受室保持漏槽条件，特别适合于溶解度小的药物。流通扩散池可与自动检测装置连接，连续测定接受介质的药物浓度。

扩散池的接受室应有很好的搅拌装置，避免在皮肤内表面有一个扩散边界层，可测定不同搅拌速度与透皮渗透的关系，确定避免扩散边界层的搅拌速率。接受室的容积应保证符合漏槽条件，即在实验过程中药物的浓度始终低于药物溶解度的10％。

2.皮肤的选择

体外经皮扩散研究最好用人的皮肤，皮肤可取自人体某一特定部位，最好是取自临床上给药系统应用部位的皮肤。已有大量文章报道了解剖部位、性别、年龄的皮肤渗透性差异，选择皮肤时应予以考虑。

尽管人皮肤是理想的经皮扩散实验材料，但人皮肤非但不易得到，而且很难使条件保持一致，因此常需用动物皮肤代替，选择渗透性接近人皮肤的动物皮肤将使实验结果较有意义。有很多学者研究了不同动物皮肤的渗透性，以下为一组研究者进行不同种动物皮肤体外渗透性研究结果，其渗透性大小的排列次序为：小鼠>豚鼠>羊>兔>马>猫>狗>猴>乳猪>人>黑猩猩。不同研究者采用不同的模型药物，可能得到不同的排列次序。一般认为兔、大鼠和豚鼠等动物皮肤的渗透性大于人皮肤，而乳猪和猴的皮肤与人皮肤的渗透性相近。小型猪皮肤亦被用于药物经皮吸收研究。小型猪表皮的结构、真皮乳头层、网状层、皮下组织结构都与人类的相应结构很相似，皮肤血供、附属器也与人类极相似，故常用于皮肤整形等多方面研究。但是，小型猪皮肤的毛孔粗而深，剥离的皮肤常形成明显的通道，可明显增加水溶性药物的通透性。

3.皮肤的处理

有毛动物的皮肤用前需去毛，否则影响剂型与皮肤的接触效果，带来实验误差。药理实验中常用的硫化钠溶液等脱毛剂具有较强的碱性，会改变皮肤的通透性，故在经皮渗透实验一般不推荐使用脱毛剂，而用电须刀剪去毛发。

动物皮肤如很薄，如无毛小鼠，可以用全皮进行实验，但当皮肤较厚，如猪与人的皮肤厚达几毫米，用全皮进行实验可能会产生与体内吸收较大的差异。如有人用一组同位素标记的化合物进行猪体内试验，测定吸收百分率，同时用剥取的不同厚度的皮肤进行体外渗透实验，以透过皮肤的百分率与体内试验值进行比较，得表2-14数据。

从表2-14可见，随lgK值（辛醇/水分配系数的对数值）的增大，体内渗透百分率与体外渗透值之间的差异越来越大。非极性化合物体外通过全皮的渗透率（％）显著小于体内渗透百分率，但通过去真皮皮肤体外渗透率增大，并与体内渗透率接近。这是因为体内试验时药物扩散通过表皮后即被真皮上部的毛细血管吸收，皮肤在离体条件下毛细血管失去作用，真皮成为扩散屏障。水溶性药物容易扩散通过真皮，真皮对它的透皮速率影响小，而非极性药物难于渗透通过真皮。为了克服这个问题，可以在体外渗透实验时使用去真皮的皮肤。

经皮渗透研究中有时需要研究药物在皮肤各层组织中的渗透特性，因此需要将表皮与真皮分离，其分离方法有热分离法、化学分离法与酶分离法。

一定的温度可以使表皮与真皮之间的结合力丧失，因此可用来分离表皮。将人皮肤放在50℃的热板上2min，可使表皮很容易与真皮分离。热水的温度更易控制，将人皮肤悬于60℃水中，经30s表皮与真皮就可分离。分离不同动物皮肤的表皮，皮肤受热时间长短可能不一样。这种方法不能用于有毛皮肤，因为当表皮从真皮上剥离时毛发留在真皮上，表皮上留下孔隙。温度对皮肤活性的影响需要引起注意，加热可能使得某些酶失活，然而因为受热时间短大部分酶的活性不受影响。

将皮肤浸在一些化学药品溶液中，表皮与真皮亦可以分离，浸泡的时间通常需几小时，然而皮肤的活性可能丧失。皮肤浸在各种盐类的2mol/L溶液中可使人皮肤的表皮与真皮分离，其中作用较强的阴离子是溴离子、硫氰酸根、碘离子，而醋酸根、硫酸根和枸橼酸根离子是无效的。化学分离方法在一定条件下能用于有毛动物皮肤，分离过程中毛能留在表皮上。如将28天龄的wistar大鼠皮肤浸在2mol/L NaBr溶液中24h，表皮能和真皮分离，然而7～8周龄的大鼠皮肤同样处理就无效。

有些研究需要在角质层内进行，如测定药物在角质层的渗透行为和测定药物在角质层与介质中的分配系数。取皮肤置于用0.001％胰蛋白酶磷酸盐缓冲液浸湿的滤纸上，真皮面与滤纸接触，于37℃培养24h，用棉签将角质层从糊状物中分离，用水漂洗后铺于铝箔上，空气干燥后即可得分离的角质层。

如要研究角质层在药物经皮渗透中的作用，可用胶黏带剥离角质层，以去角质层的皮肤与全皮进行对比试验。剥离角质层方法是将胶黏带贴于皮肤上，轻按后撕去，重复应用20次，每次用新的胶黏带，这种方法亦可用来测定药物在角质层内的分布。

4.皮肤的保存

经皮渗透研究用的皮肤最好新鲜取用，然而常需保存部分皮肤留待以后的实验，如人的皮肤不能随时取用，需要保存。皮肤的贮存条件与皮肤的活性有关，贮存应该不影响皮肤的透过性或代谢活性。

临床上已有若干方法用来保存移植用的皮肤，如将皮肤置于含有抗生素的生理盐水或组织培养液于4℃贮存，也有用低温冷冻贮存和冷冻干燥贮存。贮存方法对皮肤的影响有用皮肤移植的成功率、皮肤细胞培养和皮肤代谢活性等方法和指标来衡量。

已有研究报道了贮存条件对皮肤透过性的影响，取新鲜人皮肤测定3H-H2O的透皮系数，然后置于密闭的塑料袋中于-20℃贮存一定时间后再测定透皮系数，9个皮肤样本中有2个在贮存2个月后透皮系数显著提高，而其余的样本贮存2～12个月后透过性没有变化。有些研究结果认为冷冻保存能使皮肤的屏障性能受到损害。为了有利于分析实验条件对结果的影响，实验应记录皮肤供体死亡到采皮的时间，皮肤的保存条件与贮存时间。

5.接受液的选择

接受液应具有接受通过皮肤的药物的能力，在体内药物渗透通过皮肤能很快被皮肤血流移去，形成漏槽条件，体外实验时接受液亦应提供漏槽条件。接受液应有适宜的pH（7.2～7.3）和一定的渗透压。常用的接受液有生理盐水、林格液和等渗磷酸盐缓冲液等。

接受液接受药物的能力主要与药物的溶解度有关。对于一些脂溶性化合物，如油/水分配系数大于103以上的药物，由于它们在水中溶解度小，通过皮肤后难于进入水溶液，在体外测得的经皮渗透速率往往会小于体内值。为此需要在接受液中加入一些非生理性成分增加药物的溶解度，如一些醇类和非离子型表面活性剂等，其中20％～40％聚乙二醇400生理盐水较为常用。

体外经皮渗透实验往往需要一天以上时间，因此需要在接受液中加入防腐剂抑制微生物生长。防腐剂的选用原则是：不影响皮肤透过性，不和药物相互作用，不影响药物浓度分析，使用浓度低和在接受介质中稳定的。文献报道中所用的防腐剂有：0.005％～0.01％庆大霉素、0.02％叠氮化钠等，40％聚乙二醇400亦有抑制微生物生长的作用。

接受液加入接受室，由于温度的改变会产生气泡，在单室扩散池中气泡上升至皮肤界面影响扩散的进行，因此接受液预先需要脱气。

6.温度控制

为了减少药物经皮渗透实验的差异，控制温度是重要的。大部分体外经皮渗透实验用的扩散池有水夹层，水浴温度的选择在文献中有不同。有的考虑与体温一样，将接受液温度维持在37℃。有的选择水浴的温度为32℃，使与皮肤表面的温度一致。有些实验在室温下进行。一般认为扩散池夹层水浴温度应使皮肤表面温度接近于生理温度32℃，单室扩散池水浴温度维持在37℃，而二室扩散池夹层水浴温度应为32℃。

7.参数的求算

在药物的经皮渗透试验中，为了描述药物通过皮肤的渗透过程，需要从累计渗透量-时间数据中求出特征参数。常用的参数有药物稳态透皮速率（Js）、扩散系数（D）、经皮渗透系数（P）与时滞（tL）。一般认为药物通过皮肤的渗透是一个被动扩散过程，常用Fick扩散定律来描述。假如应用于皮肤表面的药物是饱和系统，在扩散过程中药物浓度基本保持不变，将皮肤看做一个均质膜，则通过皮肤的药物累积量M与时间t的关系为：

式中，D为药物在皮肤内的扩散系数，cm2/s；为皮肤最外层组织中的药物浓度；h为皮肤厚度；π为常数；n为从1到∞的整数，根据计算精度要求而定。从该式中可见M-t关系是条曲线，如图2-17所示。当时间充分大时，式（2-24）的右边第三项可以忽略，则：

式（2-26）表达药物通过皮肤的扩散达到稳态时的M-t关系，即是图2-17的直线部分。由于皮肤最外层组织中的药物浓度一般不能测得，而与皮肤接触的介质中的药物浓度c0可知，当与c0达分配平衡后，可由分配系数K求得，即：

将式（2-26）代入式（2-25），并进行微分，可得稳态透皮速率J：

式中，J为药物累积渗透量-时间曲线直线部分的斜率。式（2-27）中的DK/h称为经皮渗透系数P，单位是cm/s或cm/h，它表示透皮速率与药物浓度之间的关系，即

J=Pc0　　（2-28）

如果皮肤内表面所接触的不是“漏槽”，则透皮速率与皮肤两边的浓度差Δc成正比，即：

J=P·Δc　　（2-29）

图2-17中曲线的直线部分延伸与时间轴相交，得截距，即M=0的时间，称为时滞tL。

（二）皮肤内药物残留量

药物应用于皮肤上一定时间后，皮肤中药物量与药物的性质及基质的组成有关。对于局部作用的外用制剂，皮肤是它的效应器官，皮肤中药物量与疗效有关。因此，在体外经皮渗透实验结束后需要测定皮肤内药物残留量。

体外透皮实验结束后，将皮肤从扩散池上取下，剪取有效扩散面的皮肤用适宜溶剂洗涤若干次，洗去皮肤表面残留的药物，室温干燥后用胶黏带剥离角质层一次。皮肤称重，切成小片，于组织匀浆器中加入溶剂制成匀浆，高速离心，取上清液进行药物含量测定。

（三）胶黏带剥离技术

胶黏带剥离法是一种典型的角质层分离技术（图2-18）。用胶黏带连续地粘取剥离皮肤角质层，用适当溶剂提取每层胶黏带，测定药物浓度，得到各次胶黏带所剥离下角质层细胞中的药物量，通过这种方法来计算药物在角质层中渗透性能。由Fick扩散定律，药物在角质层不同深度中的浓度c（x）与时间t有如下关系：

式中，c0为药物在角质层最浅层浓度；x为位置函数（0≤x≤L）；D为扩散系数；L为扩散路径。

药物局部应用于皮肤并渗透进入角质层后，在药物进一步扩散入活性表皮前，由于亲脂性和扩散系数的影响，药物会贮留在角质层一段时间，形成暂时的“贮库”。有人研究表明，该“贮库”的药量与药物的稳态渗透速率存在一定的相关性，利用这种相关性，可以预测局部应用药物的体内生物利用度。用药30min后胶带剥离所得药物量（A）与4天内连续用药四次，每次30min后药物进入机体的量（B）有很好的相关性（B=1.8A），对于用药时间t超过30min的，可按公式B'=B×t/30计算。

该实验方法具有非侵入性、直接等优点，可用于角质层对药物经皮渗透影响的研究。可模拟角质层受损后皮肤的渗透特点，因药物在临床上通常施于受损皮肤，故具有较高的临床相关性。随着胶黏带来源的标准化及操作标准的统一化，该方法的应用日趋广泛。

（四）离体灌流法

目前，最常用于经皮吸收研究的灌流模型主要有离体兔耳灌流模型、离体猪皮瓣灌流模型和离体猪耳血管灌流模型。离体兔耳的单程灌注模型：兔耳取下后，套管插入主要动脉内，用缓冲液灌注，通过流出物找出边缘静脉插套管，然后将它转移至灌注设备中。该模型曾用于对氨基苯甲酸乙酯应用于皮肤后的代谢研究，稳态时皮肤吸收的11％被代谢。离体兔耳灌流模型较体外扩散实验已有较大改进，但实验结果仍难以外推至人。

离体猪皮瓣的灌注模型：采用外科手术获得管状猪皮瓣，皮瓣通过表面的上腹部动脉和相应静脉独立地供给营养。动脉套管插入术2～6天后，取下皮瓣，并转移至隔离的器官灌注设备中，用含有葡萄糖、抗生素和氧的缓冲液灌注，经葡萄糖利用实验和显微镜检查证实皮瓣活性可维持10～16h。离体猪皮瓣的灌注模型既可保持角质层的物理屏障，又可维持活性表皮部分的代谢屏障，同时血管组织灌注模仿了自然血流的灌注。尽管该模型是离体的，且受到严格控制，但仍可用于研究药物的经皮吸收和代谢。如二硝酸异山梨醇酯贴片用于该模型的实验中，有13.7％的二硝酸异山梨醇酯透过皮肤的被皮肤代谢成2-单硝酸异山梨醇酯和10.0％的二硝酸异山梨醇酯被代谢成5-单硝酸异山梨醇酯。离体猪皮瓣灌流模型也可用于局部药物生物利用度、经皮吸收等研究，但存在皮肤分离过程中的形态改变、手术难度大、费用贵等问题。

离体猪耳血管灌流模型具有不需要复杂的外科手术、灌流时皮肤不改变形态及血管保持完整等优点，但皮肤活性仅能维持4h。

离体灌流法可用于局部药物生物利用度、经皮吸收、毒理及毒理动力学等研究，也可用于药物的皮肤代谢机制问题的研究，但这些离体模型存在手术操作难度大、维持存活时间短、实验技术要求高等问题。鉴于上述各模型和方法的不足，目前国内外许多学者都在研究新的经皮吸收模型。

三、角质层结构的研究方法

角质层是皮肤主要的屏障，角质层的结构变化可引起药物渗透速率的显著改变。因此，研究角质层的结构及促渗剂与其他因素对角质层结构的影响，将有助于对药物经皮渗透过程的理解。

1.差示扫描热量法（DSC）

角质层具有一般生物膜的一个普遍性质，即热致相变。DSC法已广泛应用于生物膜热致相变的研究中。对角质层进行量热扫描时会出现数个不同的吸收峰，通过研究这些吸收峰的变化，可以了解角质层结构和渗透性的改变，以及各种促渗剂处理对其的影响。对于水合的角质层，典型的DSC图谱可见四个主要相变温度：其中T1（40℃）为皮脂等松散结合的脂质或胆固醇侧链所产生的吸收峰；T2（75℃）为细胞间脂质的侧链及非极性物质所产生的吸收峰；T3（85℃）为脂质双分子层结构中，整齐排列的脂质极性头区的破坏及胆固醇刚性结构的振动所形成的吸热峰，也有研究者认为是细胞膜中蛋白质和脂质结合区的相变；T4（100℃）是细胞内角蛋白变性所致。前三个峰的变化均可逆，第四个峰的变化不可逆。图谱的特征性与角质层的水合程度有很大关系，干燥样品可能仅出现1～2个吸热峰，一般需要水合30％以上时，才会有四个完整的吸热峰出现。而且，随着水分含量的增加，其吸热峰变得尖锐且向低温区移动，T1、T2、T3三个吸热峰会下降5～10℃后趋于平稳，而T4则呈持续的一直下降。当皮肤角质层经化学处理后，其吸热峰的形状和位置会发生改变，由此可研究化学促渗剂对皮肤角质层的影响。

2.傅里叶变换红外光谱法

傅里叶变换红外光谱法是研究皮肤角质层细胞间脂质结构微观变化的重要工具，它能够提供脂质分子振动的方式，从而在分子水平上阐述角质层结构变化的机制。典型的水化角质层表现为很强的氨基峰（1500～1700cm-1）和水峰（3000～3600cm-1），其中靠近2850cm-1和2920cm-1的峰为对称和C—H伸缩振动峰，它主要来自于角质层脂质中的C—H链的吸收。所以，皮肤角质层脱脂后，对称和反称C—H伸缩振动峰吸收强度明显减弱，脂质长链排列有序性降低，C—H伸缩振动峰发生蓝移，即向高波数方向移动。

近年发展起来的衰减全反射傅里叶红外光谱法（ATR-FTIR），系将角质层夹于药物供给室和ATR晶体之间（图2-19），监测在扩散过程中不同时间段的药物或其他赋形剂的红外特征吸收峰的出现和强度，将此吸收值转化为浓度，通过Fick第二定律，进一步求算经皮渗透的有关参数。该方法能直接测定穿透角质层的药物浓度，且体外、体内研究均可采用。

式中，c0为药物在角质层的稳态浓度，即溶解度，因为药物不能渗透通过ATR晶体，最终必将在角质层中达到饱和浓度，通过该模型分析，可得到分配系数（即供给室浓度除以c0）及D/L2等经皮渗透参数。

Watkinson等以ATR-FTIR为检测手段，用丙二醇（PG）为溶剂，成功考察了4-氰基苯酚（4-CP）、12-叠氮基油酸（12-AOA）等经皮渗透促进剂对药物经皮渗透的影响（图2-20），探索渗透促进剂在人体皮肤角质层中的作用机制。

3.荧光光谱法

通过荧光分析光谱法研究角质层脂质双分子层中脂质相的特征，是将一个亲脂性的荧光探针1，6-二苯基-1，3，5-己三烯（DPH）插入到脂质双分子层中研究其光谱特征，通过探针光谱参数的变化，反映角质层脂质微结构的变化。主要光谱参数有：DPH的寿命τ，包括长寿命τ1和短寿命τ2；极限各向异性运动rinf和序参数S。荧光分析法研究皮肤角质层的渗透性，是近年来发展起来的一个新方法。

四、经皮吸收的体内研究方法

药物经皮给药后欲使机体吸收产生治疗作用，则需要知道药物被机体吸收的量，体外经皮渗透实验虽然能提供有用的资料，但与体内吸收有一定的差异，因此经皮给药系统的开发过程需进行体内研究。体内研究的目的：①生物利用度、生物等效性的研究；②系统毒性的发生率及其程度的研究；③确立血药浓度与疗效的关系。

1.体内药物分析

经皮给药系统的药物一般剂量都较小，经吸收进入体内的量少，血药浓度往往低于一些分析方法的检测限度，因而对体内药物浓度的检测方法要求较高。经皮给药系统的体内分析可直接测定经皮给药后的体内药物及代谢物浓度；或用同位素标记药物，在生物样品中测定放射活性；也可通过测定与药物有关的生理反应或引起的体内化学物质浓度变化间接获得。如胰岛素的经皮给药系统可通过测定体内血糖浓度变化间接获得胰岛素在体内的作用过程。

高效液相色谱法在生物分析中占有重要地位，在经皮给药系统的体内研究中同样也经常应用。但常规的高效液相色谱法可能达不到经皮给药系统体内研究的要求，必须结合药物的结构、理化性质和样品特点，改进样品的分离、富集方法，或选择合适的检测器来提高检测的灵敏度，达到可应用于经皮给药系统体内研究的目的。

放射免疫分析法（RIA）是一种竞争蛋白结合分析法，随着很多RIA试剂盒的商品化，RIA在生物分析中的应用越来越广泛，目前也有一些透皮给药的体内测定采用了RIA，以满足透皮给药后浓度低样品检测的需要，如激素类药物促黄体激素、睾酮、雌二醇等。

同位素示踪技术在经皮给药的测定中也用得较为普遍，尤其为了获得经皮给药的生物利用度，将经皮给药系统与经同位素标记的药物同时应用于动物或人体，可获得经皮给药系统与口服或注射相比较的生物利用度。稳定同位素可在合成中引入药物分子，从而得到稳定同位素标记的药物，常用的稳定同位素有2H、13C、15N和18O等。稳定同位素标记药物主要通过质谱法进行检测，利用稳定同位素与其较轻核素间的质量差异进行定性和定量。现在常用气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱-质谱联用法进行分离和检测，专一性强，检测量一般为纳克水平或更低。

2.生物利用度测定

生物利用度测定是最常进行的体内研究。经皮给药制剂的生物利用度F测定有血药法、尿药法和血药加尿药法。

血药法是受试者分别给予药物的经皮给药制剂和静脉注射，测定一系列时间的血药浓度，根据血药浓度时间曲线AUC计算生物利用度。

经皮吸收量=CL·AUCTTS　　（2-33）

式中，AUCTTS为经皮给药制剂给药后测得的血药浓度时间曲线下的面积；CL为药物的总体清除率，它由静脉注射一个剂量Div后测定得到的AUCiv计算

CL=Div/AUCiv　　（2-34）

式中，DTTS为经皮给药制剂的剂量。

尿药法是给药后测定药物在尿中排泄的累积量Ae计算生物利用度。

经皮吸收量=AeTTS/fe　　（2-36）

式中，fe为药物在尿中排出的分数，它由静脉注射后尿中排泄累积量求得。

fe=Aeiv/Div　　（2-37）

3.药效学方法

药效学方法可用来评价外用皮质激素类药物的生物等效性。皮质激素类药物具有可使皮肤变白或收缩皮肤微血管这一性质。该性质与药物暴露持续时间（剂量持续时间），即进入皮肤的药量有关，因此可成为外用皮质激素类制剂生物等效比较的依据。皮质激素使血管收缩、皮肤变白的反应，可用色度计测定。在受试者的左右手臂，对称使用参比制剂、试验制剂及空白对照，于一定时间点，测定皮肤变白程度，利用梯形法计算参比制剂与试验制剂的药效曲线下面积（AUEC），用于生物等效性对比。

4.表面消失法

药物应用于皮肤上后渗透进入皮肤，继而被吸收进入体循环，皮肤表面药物量不断减少。药物从皮肤表面消失的速率或量与机体的吸收速率与量有一定的关系。

当时间充分大后留在皮肤内的药物量可忽略，药物从皮肤表面消失的量可作为药物被机体吸收量。一般，药物经皮吸收的速率较慢，短时间内皮肤表面药物量的差异不显著，留在皮肤表面的药物量远远大于被吸收的药物量，因此需要高回收率的操作方法和高精确度的分析方法才能得到有用的数据。可用同位素标记的药物，当药物用于皮肤表面后，以一定时间间隔用Geiger计数器测定皮肤表面同位素强度的降低，来计算药物被机体吸收的量。表面消失法误差较大，且不能真正反映出渗透进入机体循环系统的药物量，故一般不予釆用。

5.微透析法

微透析是一种膜取样技术，是在组织中植入一支薄的具半透性的透析管，模仿毛细管的作用，通过对透析液进行分析，检测人或动物细胞间液中内源性和外源性物质或经皮吸收时的药物浓度（图2-21）。微透析试验装置，一般包括微量注射泵、灌注液、探针和收集器，此外尚需相匹配的微量检测技术。

Hegemann等将微透析引入经皮给药的研究中，以烟碱为模型药物，测定皮肤中的烟碱浓度而不是血中的浓度。因透析液中的药物浓度与透析组织中药物浓度的关系事先在体外实验中得到证实，并假设在体内也有这种类似的关系，由此可通过透析液药物浓度的测定从皮肤中获得有关的药动学参数。因皮肤中的烟碱浓度可达4～18μg/ml，是相应的血中浓度的500倍，因此对检测手段的要求显著降低，用一般的HPLC即可获得解决。另外，有人采用此技术研究尼古丁甲酯透过离体人皮、重建表皮及在体人皮的过程，发现微透析技术可作为体内外相关性研究的一种有效工具。

微透析法为皮肤生理代谢、病理生理、药物的经皮吸收及皮肤药代动力学等领域的研究工作提供了新的方法和方向。但该方法不适用于蛋白结合度高的物质或亲脂性物质，可能由于现有的渗析液分析技术不够灵敏。

6.活体取样法

釆用活体取样器可用于测定动物实验中皮肤用药后局部组织中的药物浓度，分析药物经皮吸收的情况，图2-22为活体取样器示意图。